PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡(jiǎn)稱。又稱為特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法，這種方法可以把極微量的靶DNA特異地?cái)U(kuò)增上百萬(wàn)倍，是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大革新。PCR技術(shù)憑借特異性強(qiáng)、靈敏度高、對(duì)檢測(cè)樣品要求低、方便快捷等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于各種臨床診斷。目前國(guó)內(nèi)二級(jí)以上的醫(yī)院都在開(kāi)展PCR技術(shù)的各種臨床應(yīng)用，PCR實(shí)驗(yàn)室是承載PCR技術(shù)應(yīng)用的設(shè)施，實(shí)驗(yàn)室的合理設(shè)計(jì)才能確保檢測(cè)結(jié)果的可靠性，因此，PCR實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)和建設(shè)越來(lái)越受到建設(shè)單位的重視。PCR實(shí)驗(yàn)室的核心問(wèn)題是避免污染，所以從試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣品制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)如何保證生物安全，平面布局和通風(fēng)空調(diào)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)要點(diǎn)又應(yīng)注意哪些問(wèn)題展開(kāi)論述供設(shè)計(jì)同行和醫(yī)療建設(shè)單位的相關(guān)人員參考。
PCR實(shí)驗(yàn)，即臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，是專門(mén)用來(lái)檢驗(yàn)艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測(cè)手段。它可以通過(guò)將病毒體內(nèi)所含的基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，測(cè)出一些病毒含量不高的感染者體內(nèi)是否含有特定的病毒。就新冠病毒核酸檢測(cè)來(lái)，RT-PCR是目前使用最廣泛和較準(zhǔn)確的篩選和確認(rèn)方法。
實(shí)驗(yàn)室的平面布局、空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計(jì)、氣流控制等都是圍繞同一個(gè)核心問(wèn)題進(jìn)行——“避免污染”，任何級(jí)別的醫(yī)院在建設(shè)PCR實(shí)驗(yàn)室時(shí)，均需要提前考量各個(gè)因素，以保證標(biāo)本的全環(huán)節(jié)質(zhì)量及實(shí)驗(yàn)室的生物安全。
1.建設(shè)要求。PCR實(shí)驗(yàn)室的建設(shè)需要設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)的“四區(qū)”：試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、PCR擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)區(qū)。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，各區(qū)通過(guò)氣壓調(diào)節(jié)，使整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)過(guò)程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染，并降低擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)人員和環(huán)境的污染。2.人員要求。進(jìn)入PCR實(shí)驗(yàn)室，需要經(jīng)過(guò)從基礎(chǔ)理論、實(shí)驗(yàn)原理、規(guī)范操作、質(zhì)量保證到注意事項(xiàng)等規(guī)范的培訓(xùn)，并獲取PCR上崗證。 3.檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)。檢測(cè)過(guò)程中，樣本的開(kāi)蓋，核酸提取的震蕩、離心都有可能生氣溶膠，有感染的風(fēng)險(xiǎn)。4.防護(hù)要求。必須按照生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)要求進(jìn)入。
二、PCR實(shí)驗(yàn)的污染來(lái)源都有哪些？
1.樣本間交叉感染：收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴(yán)導(dǎo)致外溢；不同樣本移液時(shí)忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖；移液器等實(shí)驗(yàn)器具及耗材未及時(shí)消毒滅菌；不同樣本同時(shí)開(kāi)蓋或樣本劇烈震蕩、反復(fù)吹吸導(dǎo)致氣溶膠形成擴(kuò)散，相互交叉污染。
2.實(shí)驗(yàn)試劑污染：主要是在 PCR 組分試劑加樣過(guò)程中，由于移液器、容器、陰性對(duì)照及其它試劑被核酸模板或陽(yáng)性對(duì)照污染。加樣過(guò)程中，因?yàn)镻CR試劑對(duì)溫度十分敏感，需要通過(guò)冰浴使得PCR試劑和PCR板/管處于0℃，但這個(gè)過(guò)程也充滿污染風(fēng)險(xiǎn)。
3.擴(kuò)增產(chǎn)物污染：大量拷貝的產(chǎn)物泄漏或擴(kuò)增后的PCR反應(yīng)管意外開(kāi)蓋，這是PCR反應(yīng)中最主要、最常見(jiàn)的污染問(wèn)題。因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽(yáng)性。
4.克隆質(zhì)粒污染：作為陽(yáng)性質(zhì)控品的克隆質(zhì)粒外溢。
1.正確佩戴手套：手套未緊密貼合拇指、食指和中指，在進(jìn)行開(kāi)蓋操作時(shí)容易發(fā)生交叉污染。
2.正確使用生物安全柜：簡(jiǎn)單、整潔、避免通風(fēng)口堵塞；操作前后紫外線照射，消毒劑隨手可及；廢液缸里有1/3體積的含氯消毒液，并且及時(shí)清理廢液缸，保證廢物不超過(guò)廢液缸體積的2/3。
3.核酸提取儀去污染：每天多批次檢測(cè)時(shí)，在每一批次檢測(cè)完以后必須用75%的乙醇和核酸去除劑對(duì)儀器進(jìn)行去污染。
4.重視通風(fēng)：不定期對(duì)房間進(jìn)行通風(fēng)，每次至少持續(xù)30min。
5.PCR擴(kuò)增區(qū)去污染：PCR反應(yīng)管必須蓋緊，避免擴(kuò)增后的核酸對(duì)環(huán)境的污染。
6.實(shí)驗(yàn)室隨手可及的消毒劑。
四、PCR實(shí)驗(yàn)室的空氣流向與環(huán)境消毒前文提到，PCR實(shí)驗(yàn)室可分為試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物檢測(cè)區(qū)四個(gè)區(qū)域，這四個(gè)區(qū)域在物理空間上必須完全相互獨(dú)立，各區(qū)域無(wú)論是在空間上還是在使用中，應(yīng)當(dāng)始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣的直接相通。所以，臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的空氣流向應(yīng)按：試劑準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→產(chǎn)物檢測(cè)區(qū)，應(yīng)時(shí)刻防止擴(kuò)增產(chǎn)物順空氣氣流進(jìn)入擴(kuò)增前區(qū)域?？砂凑丈鲜鲰樞騾^(qū)域空氣壓力遞減的方式進(jìn)行，也可通過(guò)安裝排風(fēng)扇、負(fù)壓排風(fēng)裝置或其他可行方式實(shí)現(xiàn)。
臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境清潔：《臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室工作規(guī)范》中有對(duì)物表清潔、消毒的要求，不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。1.基本原則：由清潔區(qū)向污染區(qū)進(jìn)行，潔具不可交叉。2.清潔消毒方向：準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→產(chǎn)物檢測(cè)區(qū) 3.清潔消毒范圍：工作區(qū)域的物體表面(含桌、椅)，可使用含氯消毒劑擦拭消毒，空氣和工作臺(tái)面可使用紫外線照射消毒，也可使用空間消毒器進(jìn)行全環(huán)節(jié)消毒。4.不可使用紫外線消毒器及化學(xué)消毒進(jìn)行有人狀態(tài)下的消毒。5.PCR室內(nèi)的消毒應(yīng)防止揚(yáng)塵（減少人員走動(dòng)）、殺滅DNA或RNA的基因片段。可選擇懸掛紫外線燈管進(jìn)行空氣消毒，試驗(yàn)前照射30-60分鐘，實(shí)驗(yàn)結(jié)束照射30-60分鐘，必要時(shí)延長(zhǎng)照射時(shí)間（可照射一夜）。6.終末消毒：當(dāng)出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室污染時(shí)，應(yīng)按要求立即撤出相關(guān)人員，在無(wú)人情況下可使用化學(xué)消毒劑進(jìn)行終末消毒，如熏蒸法：過(guò)氧乙酸1g/ m3加熱熏蒸（濕度70-90%），密閉24小時(shí)；氣溶膠噴霧：3%過(guò)氧化氫：20mL/m3氣溶膠噴霧；5%過(guò)氧乙酸2.5mL/m3氣溶膠噴霧（濕度20-40%）。
1.每日工作前后，對(duì)工作區(qū)域表面、地面進(jìn)行清潔并消毒，使用含氯消毒液擦拭。清潔采用濕式、不揚(yáng)塵的方式進(jìn)行。
2.物品防塵存放。墻面定期清潔，有可見(jiàn)污染及時(shí)進(jìn)行清潔消毒。
3.配備移動(dòng)紫外線消毒裝置進(jìn)行空氣和物表的消毒。
4.生物安全柜的消毒：
a.每天工作前：對(duì)生物安全柜的內(nèi)表面進(jìn)行消毒，包括工作臺(tái)面和內(nèi)壁使用消毒劑擦拭。
b.工作結(jié)束：柜內(nèi)物品全部消毒后移出。消毒劑擦拭臺(tái)面四周、以及玻璃內(nèi)側(cè)燈部位。
c.消毒劑應(yīng)選擇能夠殺死生物安全柜里可能發(fā)生的任何微生物（70%乙醇、含氯消毒劑）。在使用漂白劑等腐蝕性消毒劑后，還應(yīng)用無(wú)菌水再次進(jìn)行擦拭。
d.停用生物安全柜前，運(yùn)行5min以凈化內(nèi)部空氣。
e.終末消毒：需要進(jìn)行終末消毒的時(shí)機(jī)：生物安全。
六、試驗(yàn)完成后，物品及環(huán)境如何處理？2.實(shí)驗(yàn)室空間消毒：在室溫，50-60%濕度條件下，使用過(guò)氧乙酸熏蒸2g/m3，過(guò)夜；或使用20g/l氣溶膠噴霧，用量8g/m3； 3.物體表面消毒液：0.55%含氯消毒劑，現(xiàn)用現(xiàn)配，24小時(shí)內(nèi)使用。 以上從核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)要求，工作要求等方面讓我們對(duì)PCR實(shí)驗(yàn)室有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。核酸檢測(cè)要求嚴(yán)謹(jǐn)，容不得半點(diǎn)疏忽，一個(gè)看似簡(jiǎn)單的結(jié)果背后都是每位檢驗(yàn)者汗水的結(jié)晶！
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